PCR引物設(shè)計(jì)的基本思路

根據(jù)PCR實(shí)驗(yàn)需要，確定需要擴(kuò)增的DNA序列，并知道其CDS區(qū)序列（編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū),即從起始密碼子區(qū)至終止密碼子區(qū)） ncbi網(wǎng)站查詢
 

 RBS             149..153

 1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc

 

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2.選擇所需的載體,確定合適的酶切位點(diǎn)。

所選擇的酶切位點(diǎn)盡量為多克隆位點(diǎn)的中間酶切位點(diǎn)，且載體上其它地方無(wú)該酶切位點(diǎn)。這樣連接以后再構(gòu)建新的質(zhì)粒時(shí)選擇酶的空間更大些。并保證所需擴(kuò)增的DNA序列中無(wú)該酶切位點(diǎn)（generuner分析）。

3.初步確定設(shè)計(jì)的引物長(zhǎng)度。

 一般為15～30bp，引物過(guò)短會(huì)影響到擴(kuò)增的特異性，過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響擴(kuò)增速率。如果擴(kuò)增產(chǎn)物≤500bp，引物長(zhǎng)度為16～18bp即可。若擴(kuò)增產(chǎn)物為4～5kb，引物最好不要少于24bp。引物3’末端應(yīng)含有所研究基因特異序列中的17～30bp。

4. 正向引物的設(shè)計(jì)：

4.1 酶切位點(diǎn)的位置選擇。一般情況下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位點(diǎn)，然后利用該酶將擴(kuò)增產(chǎn)物切下，接到相應(yīng)的載體上。

A：擴(kuò)增的DNA用于表達(dá)時(shí)：

自身有啟動(dòng)子。如：

LOCUS       VITVHBA                  689 bp    DNA     linear   BCT 26-APR-1993

DEFINITION Vitreoscilla sp. hemoglobin (VHb) gene, partial cds.

ACCESSION   M30794 M31721 X13516

VERSION     M30794.1 GI:155319

KEYWORDS    hemoglobin; promoter region.

SOURCE      Vitreoscilla sp.

 ORGANISM Vitreoscilla sp.

REFERENCE   1 (bases 42 to 689)

 AUTHORS   Khosla,C. and Bailey,J.E.

 TITLE     The Vitreoscilla hemoglobin gene: molecular cloning, nucleotide

 JOURNAL   Mol. Gen. Genet. 214 (1), 158-161 (1988)

 MEDLINE   89143453

REFERENCE   2 (bases 1 to 210)

 AUTHORS   Khosla,C. and Bailey,J.E.

 TITLE     Characterization of the oxygen-dependent promoter of the

 JOURNAL   J. Bacteriol. 171, 5995-6004 (1989)

COMMENT     Original source text: Vitreoscilla sp. DNA.

FEATURES             Location/Qualifiers

    -10_signal      73..79

ORIGIN     

擴(kuò)增片段里應(yīng)包含啟動(dòng)子，所以酶切位點(diǎn)應(yīng)該在啟動(dòng)子前面。

可在所擴(kuò)增的DNA序列的啟動(dòng)子前尋找是否有該酶切位點(diǎn)，若有則直接利用該酶切位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增；若無(wú)可尋找與其基本相似的位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。

（2）擴(kuò)增片段里自身無(wú)啟動(dòng)子。

因?yàn)樵?’端增加的酶切位點(diǎn)（所選的酶切位點(diǎn)與啟動(dòng)子的酶切位點(diǎn)相同）中必須含起始密碼子，如NcoI（CCATGG），Nde I(CATATG),設(shè)計(jì)引物時(shí)，酶切位點(diǎn)的起始密碼子要和DNA序列的起始密碼子重疊.如上例：若添加的酶切位點(diǎn)為NdeI，引物的5’端酶切位點(diǎn)應(yīng)設(shè)計(jì)位5’—CATATGTTAGAC—3’;若添加的酶切位點(diǎn)為NcoI,因?yàn)槠湮稽c(diǎn)ATG后的G與DNA起始密碼子后的T不配對(duì)，在處理這個(gè)問(wèn)題上有兩種方法：一種是用G取代T,其缺點(diǎn)是破壞了閱讀框，可能對(duì)表達(dá)會(huì)有影響；另外一種方法是將酶切位點(diǎn)上的G改為T,相應(yīng)的酶切位點(diǎn)應(yīng)改為ACATGT,并查詢是否有該酶存在,若有，可以直接利用，因?yàn)橥裁敢部蛇B接。若無(wú)，可用平末端連接。

B：若擴(kuò)增的DNA用于阻斷.如eryF:

 1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc

 因?yàn)橹恍枰獢U(kuò)增出一定長(zhǎng)度的與染色體DNA同源的序列就可以，所以對(duì)酶切位點(diǎn)的位置無(wú)特殊要求。只需要尋找與所需擴(kuò)增的DNA配對(duì)較好的區(qū)域作為酶切位點(diǎn)就行。如上，可選擇ggatcc.

4．2克隆PCR產(chǎn)物的方法之一，是在PCR產(chǎn)物兩端設(shè)計(jì)一定的限制酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切克隆到用相同酶切的載體上。但實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)限制酶對(duì)裸露的酶切位點(diǎn)不能切斷。必須在酶切位點(diǎn)旁邊加上一個(gè)至幾個(gè)保護(hù)堿基，才能使所定的限制性酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行有效切斷。加的個(gè)數(shù)見(jiàn)Biolabs242所示，加的種類要和擴(kuò)增的DNA序列相匹配。如NdeI,Biolabs顯示在其酶切位點(diǎn)上加4個(gè)核苷酸時(shí)，酶切2小時(shí)，酶切效率達(dá)到50%，而加1個(gè)核苷酸時(shí)，酶切20小時(shí)酶切效率仍然為0%，所以應(yīng)在酶切位點(diǎn)前加4個(gè)核苷酸；為了達(dá)到盡可能與需要的DNA配對(duì)，所以應(yīng)選gaac;

4.3 在所添加的酶切位點(diǎn)后加17-30個(gè)與擴(kuò)增的DNA配對(duì)的核苷酸序列。

結(jié)合以上幾點(diǎn)，對(duì)于vhb基因5’端引物可以為5’---gaac CATATG ttagac cagcaaacca ttaacatc—3'。

對(duì)于eryF基因可設(shè)計(jì)為5’--nnnggatcccgat cgtgtcggag gaag—3’

4不同細(xì)胞對(duì)密碼子的使用頻率各不相同，密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)tRNA的豐富是一致的，密碼子使用頻率高意味著需要較多的相應(yīng)tRNA，二者之間的相互協(xié)調(diào)有利于細(xì)胞內(nèi)一些含量高的蛋白質(zhì)的順暢表達(dá)。同理，當(dāng)人們期望人工合成的基因能在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，也要選擇該細(xì)胞偏好的密碼子作為基因的密碼子，這樣可以充分利用細(xì)胞內(nèi)豐富度高的tRNA，使基因得到高效表達(dá)。所以對(duì)引物起始密碼子以后的幾個(gè)密碼子要根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性進(jìn)行改變。大腸桿菌基因密碼子的使用情況：原核生物的代表大腸桿菌基因的研究開(kāi)展最早，進(jìn)展也最快。比較了大腸桿菌中13種含量較多的蛋白質(zhì)的密碼子使用情況發(fā)現(xiàn)這些高度表達(dá)的基因中密碼子的使用有以下規(guī)律：對(duì)于以C或U結(jié)尾的同義密碼子，如前兩個(gè)堿基為A、U，則第三個(gè)堿基優(yōu)先使用C；前兩個(gè)堿基為C、G，則第三個(gè)堿基優(yōu)先使用U。這樣的選擇有利于在翻譯時(shí)密碼子與反密碼子相互作用，兩者的作用能不太強(qiáng)也不太弱，而一中度為宜即所謂最適相互作用能。

 

 

5.反向引物的設(shè)計(jì)

表達(dá)時(shí)，要考慮終止密碼子的位置，所擴(kuò)增的片段里必須包括終止密碼子 ，所以酶切位點(diǎn)應(yīng)該在終止密碼子后尋找。酶切位點(diǎn)的選擇原理與5’端一樣。

擴(kuò)增的DNA用于阻斷。與表達(dá)時(shí)相同，只是無(wú)需過(guò)于要求酶切位點(diǎn)的位置。

6.應(yīng)注意堿基分布的均衡性。引物應(yīng)避免嘌呤或嘧啶的堆積現(xiàn)象，避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的同一堿基。

7.檢查兩條引物是否存在二級(jí)結(jié)構(gòu)或二聚體。（dnaman分析）如上，VHB ggatcccgat cgtgtcggag gaag；

Two primers complementarity.

Max complementarity in continuous: 4 bp, free energy=-1.60 Kcal/mol

3'-GGCTGGTGTATCCTGTCGCCTAGGTG-5'

Max complementarity in discontinuous: 9 bp

5'-CCCTGCAGCAGTCGCTGGGTGAG-3'

 3'-GGCTGGTGTATCCTGTCGCCTAGGTG-5'

8.計(jì)算Tm值。

一般退火溫度為55℃～60℃，而Tm值比退火溫度高5～15℃。兩條引物的Tm值最好相同，相差不要超過(guò)3℃。

9.特異性分析。必須保證酶切位點(diǎn)后的特異性序列在已知的序列中不存在，否則會(huì)出現(xiàn)非特異性條帶。

EryF引物

正向:

 5’-AAGGATCCAAGTCGCGCCGCCC-3’

反向:

 5’-CAAGGATCCCATGCTGTGCCCGAA –3’

 

PCR反應(yīng)量的選擇：

要擴(kuò)增的是總DNA，在PCR反應(yīng)前應(yīng)預(yù)先變性總DNA（即100℃水浴中煮沸5～10min）

酶的選擇

對(duì)于擴(kuò)增高GC的片段，應(yīng)使用LA Taq 酶，緩沖液也應(yīng)該用GC Buffer.

3. 酶量的選擇

酶量過(guò)多時(shí)易發(fā)生非特異性反應(yīng)；而酶量過(guò)少時(shí)，反應(yīng)性能下降。一般50ul的體系可使用2.5U的酶（即5U/ul,加0.5ul）

模板DNA的用量

總DNA為0.1～1 ug；片段DNA為0.1～10ng。

引物用量

終濃度為0.1～1.0uM。引物濃度太低時(shí)，有時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物太少；引物濃度太高時(shí)，比較容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)。通常模板DNA的量較多或High complexity DNA(如總DNA)作模板時(shí)，引物濃度應(yīng)該低一些；當(dāng)模板DNA的量較少或Low complexity DNA（如plasmid等）作模板時(shí)，引物濃度應(yīng)高一些。

 ddH2O              9.5ul

 2×Gcbuffer        25ul 用量參考TaKaRa目錄

 dNTP               8ul

 Primer 1 0.5ul (稀釋后的濃度為25uM,終濃度0.25umol/L)

 Primer 2 0.5ul(終濃度0.25umol/L)

 LA Taq 0.5ul(產(chǎn)品濃度為5U/ul)

 總DNA 6ul(濃度是0.05 ug/ul,質(zhì)量為0.3ug)

 50ul體系

PCR反應(yīng)

PCR的反應(yīng)液應(yīng)在冰中調(diào)制，然后安置于PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。這種冷啟動(dòng)法可增強(qiáng)PCR反應(yīng)的特異性，減少PCR反應(yīng)中的非特異性帶，能得到良好的PCR反應(yīng)結(jié)果。

PCR反應(yīng)條件的選擇

變性時(shí)間、溫度及延伸溫度基本固定

退火溫度一般為55～60℃，對(duì)于GC%小于50%，一般用55℃；GC%≥50%時(shí)一般用60℃。退火溫度太高會(huì)得不到擴(kuò)增產(chǎn)物；太低時(shí)容易發(fā)生非特異性反應(yīng)。若此時(shí)有非特異性帶，可提高退火溫度，但不應(yīng)高于68℃，因?yàn)楹线m的退火溫度應(yīng)在45～68℃之間。

退火時(shí)間：一般以每Kb設(shè)定在30s～1min 。

延伸時(shí)間：延伸時(shí)間太短時(shí)，會(huì)的不到擴(kuò)增產(chǎn)物或者會(huì)有一些短的非特異性產(chǎn)物優(yōu)先生成；而太長(zhǎng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)涂布現(xiàn)象。一般擴(kuò)增片段≤500bp,采用1 min ;大于500bp時(shí)，采用3min。

95℃ 5min

94℃ 1.5min

65℃ 30s         ×30

72℃ 2min

72℃ 7min

 

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提示：本文PCR引物設(shè)計(jì)基本思路屬于引物設(shè)計(jì)文章，主要介紹引物設(shè)計(jì)、PCR引物設(shè)計(jì)方面的知識(shí)，內(nèi)容僅供學(xué)習(xí)交流與參考，不代表創(chuàng)博環(huán)球（北京）生物科技有限公司的觀點(diǎn)。